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一、 实验目的
客户通过CO-IP实验证实A、B两个蛋白有相互作用，想进一步通过体外实验验证，其中A蛋白大小为45kDa，亲水性较好，选用大肠杆菌系统获得GST-A蛋白; B蛋白疏水性很强，且非常大(275kDa)，普健根据多年蛋白制备经验，推荐客户选择用昆虫系统表达B蛋白(PS：昆虫杆状病毒能容纳大分子的插入片段，能包装大的基因片段)
二、 B蛋白制备流程
1、 B蛋白分析：
B蛋白一共2511AAs，无信号肽，无跨膜结构域，疏水性很强，选取1-2511AAs为表达目的片段，C端添加6*his标签;
(1)信号肽分析结果：
(2)疏水性分析结果：
(3)跨膜区分析结果：
1、 基因优化合成B蛋白，构建pFast-bac1-B表达质粒;
2、 蓝白斑筛选方法获得重组的Bacmid，经PCR鉴定阳性后，转染sf9细胞，获得P1代病毒粒子，通过P1代表达测试，鉴定是否有目的蛋白表达;
3、 生产P2代病毒粒子，进行MOI测试，选最优条件进行200ml放大及纯化，获得目的蛋白;
三、 实验结果
图1：P1代表达测试结果
A. 考马斯亮蓝染色. B. His 标签抗体WB鉴定蛋白 (ECL曝光).
图2：P2代MOI测试结果
考马斯亮蓝染色
图3：样品纯化后QC结果
A.考马斯亮蓝染色. B. His 标签抗体WB鉴定蛋白 (ECL曝光).
实验结果分析：
SDS-PAGE结果显示260kDa左右有条带，通过His 标签，WB检测曝出与目的蛋白大小一致的条带，说明SDS-PAGE胶上的条带为目的蛋白条带，蛋白纯度为90%。
蛋白表达量为：200ml可纯化到1.8mg His-B蛋白
图4：GST-A蛋白与HIS-B蛋白GST pull down实验结果
结论：GST-A蛋白与His-B蛋白是有相互作用的。
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