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无缝克隆试剂盒

发表时间:2022-01-22 访问次数:889

概述(Summary)icon

产品中文名

无缝克隆试剂盒

产品货号

ATO00037

产品描述(Description)

1.产品介绍

无缝克隆是一种新型、快速并且高效的Gibson Assembly DNA定向克隆技术,可以同时将多个DNA片段克隆到任何载体中,并且最终构建的克隆没有任何额外的碱基序列,因此被称作“无缝克隆”。

和传统的基因克隆方法相比,本试剂盒的无缝克隆技术有多方面的优势:(1)操作更简单,只需要一次反应即可完成;(2)对酶切位点无要求,可以把目的片段插入到任意载体的任意位点;(3)连接片段之间不会引入任何多余的序列,是真正的无缝克隆;(4)阳性克隆率高,降低克隆筛选的工作量。

本试剂盒操作简单,仅需将载体在插入位点进行线性化,同时将目的片段两端引物与载体插入位点同源的15-25bp序列,将线性化的克隆载体和带有同源序列的PCR片段按合适比例混合,并加入2×Master Mix,在重组酶的催化下,50℃反应30min即可快速完成定向克隆,阳性率高达90%以上。试剂盒中2×Master Mix预混了DNA外切酶、DNA聚合酶、连接酶和重组反应所需缓冲液,并添加了特殊的酶激活组分,可显著提高重组克隆效率,可以一次实现多至3-6个片段的顺序拼接克隆。

2.试剂盒原理示意图

 

 

图1. 无缝克隆试剂盒原理示意图 。 单酶切/双酶切获得线性化载体。扩增与载体带有同源臂的目的片段(蓝色和红色部分为同源部分)。按一定的比例将二者混合在2×Master Mix预混液中,50℃反应30min后直接转化E.coli即可。

产品优势(Advantage)

和传统的基因克隆方法相比,本试剂盒的无缝克隆技术有多方面的优势:

(1)操作更简单,只需要一次反应即可完成;

(2)对酶切位点无要求,可以把目的片段插入到任意载体的任意位点;

(3)连接片段之间不会引入任何多余的序列,是真正的无缝克隆;

(4)阳性克隆率高,降低克隆筛选的工作量。

储存条件(Storage)

于-20℃避光保存12个月,避免反复冻融。

运输方式(Shipping)

干冰运输。

Note

For research use only .

 

使用方法(Standard Operating Procedure)icon

1.线性化载体的制备线性化载体制备的两种方法:

(1)在目标载体质粒上选取合适的位点,进行单酶切或者双酶切,酶切后割胶纯化;

(2)反向PCR扩增载体,在线性化位点设计一对互补的引物,进行扩增。

注意:载体质粒单酶切容易造成载体切割不完全和载体自连,导致假阳性的产生,所以尽可能的选择双酶切。请务必割胶回收线性化的载体,否则残余的环状质粒会产生背景菌落。一般回收后的线性化载体浓度需要>15ng/µl。

2. 目的基因片段的制备设计引物进行目的片段的扩增:

(1)PCR引物必须包含两个部分,引物的5"端必须包含与载体末端完全同源的15-25bp碱基,引物的3’端必须包含靶基因特意引物序列。

(2)每条引物的3’端必须具有目的基因特异性,长度为15-25bp,GC%为40%-60%,退火温度Tm为58℃-65℃。PCR产物经跑胶,割胶纯化待用。

(3)当有多个片段插入时,首片段和末尾片段引物的5"端必须包含与载体末端完全同源的15-25bp碱基。其余中间片段引物的5"端必须包含与前一个片段15bp左右同源序列,3"端必须包含与后一个片段15bp左右同源序列。

  

 

 

图3.目的片段引物设计示意图

3.反应体系的设置

参考下表在冰上配制重组反应体系:

2 ×Master Mix

5ul

Linearized vector

50-200ng

Purified PCR Fragment

20-200ng

Total

10ul

反应条件:插入单个片段,一般需50℃反应30min;随着插入片段的增多,长度的加大,反应时间随之延长,一般需要45-60min。

注意:线性化载体与目的片段的加入量可以根据各自的浓度,片段的长度自行调整。目的片段与线性化载体的摩尔比在3:1左右,过高或过低都会降低重组效率。

4.转化及阳性克隆的鉴定

(1)取100μl待转化感受态,置于冰上解冻。

(2)向上述感受态细胞悬浮液中加入10μl重组好的反应液(按第3步操作),轻轻混匀,不能震荡,将该混合物置于冰上30 min。

(3)在42℃的水浴中热激90 sec,立即置于冰上保存2 min,再加入500 μl LB培养基(不含抗性),37 ℃摇床200rpm震荡培养1h左右。

(4)取上述转化混合液200-300μl,涂布在选择性固体培养基上(含相应抗生素),待菌液被培养基充分吸收后,将平板倒置于37 ℃恒温培养箱中培养过夜。

(5)挑平板上的克隆进行菌落PCR,或提质粒双酶切鉴定阳性克隆。