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卵巢癌是女性生殖系统高致死率的恶性肿瘤之一，复发和耐药问题长期困扰临床治疗。研究表明，肿瘤干细胞（OCSLCs）是推动卵巢癌恶性进展与复发的关键因素。然而，OCSLC干性的维持机制尚不清晰。PI3K/AKT通路被认为在干细胞特性和耐药性中发挥核心作用，但如何在亚型水平上特异调控仍有待揭示。中国医科大学的研究团队发表于《ADVANCED SCIENCE》的一篇文章聚焦于蛋白精氨酸脱亚氨酶家族成员PAD1，探索其在卵巢癌干样细胞中的作用机制。
PAD1在卵巢癌上调并驱动恶性表型与干性
研究人员首先在人卵巢癌组织与卵巢囊肿对照样本中检测PAD家族转录水平，发现PAD1在肿瘤中显著上调；蛋白层面的免疫组化同样显示肿瘤组织 PAD1 染色更强，提示 PAD1与肿瘤发生相关。在 OVCAR3、SKOV3 等细胞系中以慢病毒干扰 PAD1，验证了敲低效率，并观察到增殖、迁移、侵袭显著下降，以及裸鼠成瘤体积减小与IHC/WB证实的肿瘤内PAD1下降。
Figure 1. PAD1表达与OC进展呈正相关
进一步针对干性，PAD1 knockdown 使 CD133、CD44、OCT4、SOX2 表达降低；球形成效率下降；极限稀释移植（ELDA）显示肿瘤起始细胞频率降低；来源于患者腹水的原代肿瘤细胞在 PAD1 干扰后同样出现干性标志与成球/侵袭能力的下调。
Figure 2. PAD1增加OC细胞的肿瘤起始能力
PAD1 通过 AKT 通路维持干性，并与 AKT2 特异互作
RNA-seq与富集分析显示PAD1干扰后，差异基因集中富集于PI3K-AKT信号，药理抑制 PI3K/AKT（LY294002）可剂量依赖性下调干性标志。WB 显示 PAD1 敲低抑制 AKT 的关键活化位点磷酸化，而CD133⁺ 高PAD1 亚群具有更高AKT磷酸化水平；在CD133⁺ 细胞中敲低 PAD1可显著抑制AKT磷酸化。机制上，免疫共沉淀与质谱表明PAD1与AKT2形成复合体；截短体互作与GST pull-down指向AKT2激酶结构域为结合界面；对接计算亦支持二者高亲和界面。
Figure 3. PAD1通过激活AKT信号通路维持OCSLC的干性
PAD1的催化活性驱动AKT2激活：D-Cl-amidine与体外瓜氨酸化证据
在HEK293过表达体系中，PAD1 共转可提升AKT2的磷酸化；而催化失活突变体不能激活 AKT；PAD1抑制剂D-Cl-amidine（D-Cla）在细胞中剂量依赖性抑制AKT 磷酸化；纯化蛋白的体外反应（His-AKT2 + rPAD1 + Ca²⁺）被 anti-Pan-Cit 识别，提示AKT2被直接瓜氨酸化，且该反应依赖 Ca²⁺与PAD1催化活性。在细胞层面，过表达WT-PAD1提高p-AKT2的免疫荧光信号，而CS-PAD1无此效应；药理抑制PAD1能降低干性标志、抑制成球，并在小鼠移植瘤中抑制肿瘤生长与 AKT2 活性/干性标志；与PI3K抑制剂联用具有叠加抑制。
Figure 4. PAD1催化的AKT2的瓜氨酸化促进OCSLC干性维持
AKT2的R202瓜氨酸化是激酶活性与可磷酸化结构暴露的枢纽
LC-MS/MS 在体外反应产物中鉴定到AKT2的R202、R208、R371可被瓜氨酸化（均位于激酶结构域），随后研究人员构建R→E/K/A突变体鉴别功能：R202突变显著降低AKT2磷酸化，而R208/R371的多数突变不影响激活。结构建模显示，仅 R202K 破坏了 S474 与 T309 的表面暴露，为其不能被充分磷酸化提供结构学解释。进一步，由普健生物提供的位点特异的AKT2-Cit202单克隆抗体，检测到在体外与细胞内均只在 PAD1依赖下识别到R202瓜氨酸化信号；在多株卵巢癌细胞中 Cit202 显著高于 IOSE386；临床样本IHC亦显示肿瘤组织 Cit202 染色增强。
Figure 5. PAD1在R202位点对AKT2的瓜氨酸化促进OC细胞中AKT2酶活性
R202K功能验证：破坏R202瓜氨酸化可复制PAD1敲低的“抗干性”表型
在OVCAR3稳转过表达体系中，AKT2-R202K相比WT-AKT2显著降低AKT2磷酸化、R202瓜氨酸化与干性标志表达；成球与侵袭能力下降；异位移植模型中腹腔转移结节与腹水体积减少；ELDA 证实 CSC 频率下降；肿瘤组织内 p-AKT2/干性标志同步降低。这些结果与 PAD1 敲低转录谱高度重叠，提示R202位点是 PAD1-AKT2 轴维持干性的必要位点。
Figure 6. 在OC细胞中过表达AKT2R202K会阻碍OCSLC干细胞特性的维持
CEBPβ作为PAD1-AKT2的关键效应转录因子
启动子位点扫描提示CEBPβ与YY1可能共同调控 SOX2/CD44/CD133/OCT4；ChIP-qPCR证实CEBPβ富集于上述基因的近端启动子；在PAD1敲低或AKT2-R202K过表达时，CEBPβ的结合被显著削弱；伴随CEBPβ蛋白下调与干性基因转录下降。药理抑制PAD1或PI3K/AKT可剂量依赖性降低CEBPβ；二者联用叠加抑制。在PAD1存在的条件下，R202瓜氨酸化即使在AKT2 S474A失活情况下仍可部分恢复CEBPβ，提示R202瓜氨酸化除促进磷酸化外可能独立促进AKT2保持“有利构象/活性”以支持CEBPβ上调。
Figure 7. CEBPβ可能作为PAD1-AKT2信号通路的关键下游调控靶点
PAD1 抑制可重塑顺铂耐药并与AKT抑制剂协同
研究人员建立OVCAR3-CisR细胞（5 μM 顺铂维持），显示干性标志升高、球形成增强；并伴随PAD1上调、AKT2-R202瓜氨酸化增强、p-AKT与CEBPβ升高，提示 PAD1-AKT2-CEBPβ轴与耐药同向变化。D-Cla在 CisR 细胞中剂量/时间依赖地抑制 AKT2 的瓜氨酸化与磷酸化，下调干性分子并抑制增殖/成球/侵袭。与 AZD5363（AKT 抑制剂）联用出现叠加抑制；在裸鼠模型中，CisR 肿瘤对单用顺铂不敏感，但D-Cla + 顺铂可将肿瘤负荷降低至接近对照组对顺铂的反应水平，并在肿瘤组织内观察到 p-AKT2、CEBPβ 与干性标志显著下降，闭环证明了“抑制 PAD1 → 降低AKT2-R202瓜氨酸化→失活AKT2/CEBPβ→逆转耐药”的干预链条。
Figure 8. 抑制PAD1通过抑制AKT2/CEBPB信号通路使OVCAR3-CisR细胞对顺铂重新敏感
普健生物（AtaGenix）为本研究提供了位点特异的AKT2-Cit202单克隆抗体，在验证 AKT2-R202的体内外瓜氨酸化及其与干性、耐药的关联中发挥关键作用。AtaGenix 长期专注于高质量蛋白与抗体产品的开发，提供从抗体发现、定制开发到大规模生产的一站式服务，助力科研工作者高效推进机制研究与靶点验证。
截至到2025年10月，已有400余篇文献引用了普健生物的一站式蛋白抗体开发技术服务。展望未来，普健生物将继续全力支持科研工作，推动技术创新与突破。为感谢大家的持续支持，普健生物将一如既往地提供高质量的服务，我们的文献奖励活动也将长期有效。凡是在发表的论文中引用普健生物的技术服务并标注：
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