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原核表达系统案例展示

发表时间:2022-01-22 访问次数:1176

一、需求分析

  客户需求:可提供蛋白序列,希望得到纯度85%左右的500μg蛋白,蛋白后续用于酶活实验,项目预算有限,后期可能需要大量蛋白。

  需求分析

  如项目预算有限,建议优先选择原核表达系统,成本较为低廉,如后续需要进行大体积放大,可直接进行发酵,工艺成本更低;对于酶的表达,普健的大肠杆菌表达系统在已往项目中有较为积极的客户反馈; 基于以上分析,普健建议该项目选用大肠杆菌表达系统。

二、蛋白性质分析

  将蛋白序列在蛋白数据库Uniport中比对,一致性较高为80.9%,用生物信息学工具进行蛋白性质分析。

  跨膜结构域预测:

原核表达系统

 

  信号肽预测:

原核表达系统

 

  疏水性预测:

原核表达系统

 

    蛋白性质总结:客户提供蛋白序列一共234 AAs,蛋白大小为25.39 KDa,pI为8.80,疏水性一般,无跨膜结 构域,无信号肽,无糖基化及二硫键修饰。

三、实验设计

  综合蛋白性质及客户需求分析,设计蛋白表达方案如下:选择大肠杆菌表达系统,表达目的蛋白全长,N端融合6*His标签,表达载体为pET28b,选用BL21(DE3)、T7E为表达菌株,设置多个诱导温度及诱导时间,根据表达测试结果,选择最优条件进行200mL放大,收集样品采用Ni柱纯化,交付蛋白样品。

四、实验方法及实验结果

  1、表达载体构建

  利用生物信息学工具对目的蛋白全长片段进行密码子优化,降低稀有密码子水平,用化学合成方法获得目的蛋白基因序列片段,将片段亚克隆到pET28b表达载体,进行双酶切验证及测序确认。进行双酶切验证及测序确认。

  测序结果:

原核表达系统

 

  双酶切验证结果:

 

      结果分析:NdeI/XhoI双酶切测试结果显示片段大小正确,测序结果显示序列一致,确认蛋白表达载体构建成功。

  2、表达测试

  将表达载体转化至BL21(DE3)菌株、T7E菌株,挑取阳性克隆转移到含Kana抗性的LB培养基上,37℃培养3-4h,加入1mM IPTG诱导表达,一组37℃培养4h,另一组16℃培养16h过夜,收集蛋白样品进行SDS-PAGE检测。

  SDS-PAGE结果:

 

  结果分析:根据SDS-PAGE结果,蛋白大小在25KD左右,与预测蛋白大小相符,比较各条件下蛋白表达情况,确认该蛋白最优的表达条件如下:

菌株 温度 诱导时间
T7E 菌株 37℃ 4h

  3、放大纯化

  按照得到的最优表达条件,转化200mL大肠杆菌,37℃培养3-4h,1mM IPTG诱导后,37℃培养4h,收集蛋白样品,用Ni柱进行蛋白纯化,得到最终蛋白样品。

  4、QC检测

  将最终得到的蛋白样品进行浓度测定、SDS-PAGE检测及His标签抗体的WB检测。

  SDS-PAGE检测及WB检测结果:

                

 

结果分析:SDS-PAGE结果显示蛋白大小在25KD左右,且蛋白纯度较好,约为95%; His标签抗体的WB检测结果显示25KD左右曝出条带,与目的蛋白预测大小相符。

五、交付材料

序号 样品 浓度 分装 缓冲液 管数
1 蛋白 1.00mg/ml 1.50ml/管 PBS pH7.5 2管
2 表达载体 100ng/ul  15ul/管 TE 1管
3 表达菌株 /  1.00ml/管 / 1管
合计管数: 4管

六、项目结题

  从基因合成到交付蛋白样品,项目为期5周,得到3.00mg目的蛋白样品,由于酶活测试的多样性与特殊性,交付给客户进行验收及酶活测试,客户验证蛋白大小纯度均与QC结果一致,酶活实验结果表明蛋白有生物活性,综上,项目顺利结题。

 

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