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利用Single B方法快速制备高效BSA抗体对的策略

发表时间:2023-06-21 访问次数:611
研究背景

残余牛血清白蛋白(BSA)含量检测是生物制品质量控制的一项重要指标,直接关系到生物制品的使用安全。世界卫生组织及世界各国药典对残余BSA含量均有严格限定。《中国药典》(三部)2020版规定,成品中牛血清白蛋白残留量不得>50ng/剂。因此,需要利用特异性好,灵敏度高的抗体建立一种简便、高效的牛血清白蛋白残留量检测方法。

 
客户痛点

牛血清广泛使用于生物制品研究、制备过程中,虽然在生产过程中经纯化可以去除制品中大部分BSA,但微量BSA依然存在于生物制剂成品中。在人体中,超过一定浓度的BSA易引起人的免疫病理反应,引起严重的副作用,影响生物制品的安全性。普健生物基于客户需求,对BSA有更为严苛的控制标准,此前我们基于鼠抗开发平台开发出灵敏度为0.51ng/ml,可检测1.56-100ng/mL的BSA检测试剂盒。能满足现行药典规范BSA残留检测要求,并有了稳定的客户群体。但在后续的产品回访中,我们的项目经理进一步了解了客户的项目对BSA残留其实有更为严苛的控制标准,只是苦于市售产品检测限以及灵敏度未能完全满足。普健生物技术团队深挖客户需求,结合普健生物最新推出的XtenTMMab兔单克隆抗体开发技术,为客户提供了一种全新、高效、高灵敏度的BSA检测解决方案。

 
普健全新解决方案
 

本公司利用兔单B细胞抗体开发技术,从BSA免疫的兔外周血中,分离BSA特异性的单B细胞,通过PCR 扩增及测序分析, 获得多个特异性识别BSA蛋白的抗体。

本方案筛选的兔单抗较传统方法杂交瘤技术筛选的抗体及兔多抗的亲和力和特异性更高,具有灵敏度高、稳定性强的特点,检测范围为0.78-50ng/mL为开发高灵敏度的BSA残留检测试剂盒奠定了坚实的基础。

图1 普健生物XtenTMMab兔单克隆抗体开发流程

 

01
动物免疫及单B细胞分选
 

利用普健生物开发的快速免疫方法免疫新西兰大白兔,三免(Day21)血清效价大于128K,可以进行后续单B细胞流式分选。然后将从PBMC中分离筛选到的B细胞进行抗原特异性检测,阳性率大于60%。

抗原

BSA

包被

1ug/ml*100ul

 

2k

4k

8k

16k

32k

64k

128k

PBS

效价

免血清效价

4.32

3.32

3.26

2.98

2.53

1.85

1.16

0.03

>128K

图2 BSA兔血清三免(Day21)效价检测结果

图3 单B细胞ELISA检测部分结果展示

 
02
阳性抗体测序及序列分析
 

根据单B细胞ELISA检测结果,挑选12个克隆进行抗体基因测序及分析,12个克隆测序全部成功。

 

图4 抗体可变区基因分析结果

 
03
重组兔抗表达及鉴定
 

将测序得到的12个抗体挑选10个,利用普健生物自主开发的XtenCHO系统进行重组表达,纯化后得到纯度高,亲和力好的重组兔单抗。10株重组兔单抗ELISA效价均大于1:1000000。

图5 重组兔抗SDS-PAGE检测结果

 

图6 纯化后重组兔抗ELISA检测结果

 
 
04
BSA抗体对开发
 

将10株重组兔单抗进行方阵实验配对,得到多对灵敏度高的抗体对,优选其中一对, 标曲线性范围0.78-50ng/mL, R2=0.9992。

图7 BSA抗体对标准曲线

 
05
抗BSA鼠单抗和兔单抗亲和力比较
 

为了了解不同方法制备抗体亲和力的差异,我们将BSA的兔单抗与之前自产的用传统杂交瘤制备的BSA鼠单抗进行了亲和力的测试。在此,我们利用OPENSPR将鼠单抗、兔单抗和BSA进行了亲和力检测,发现兔单抗的亲和力比鼠单抗高1-2个数量级。

  ka(1/Ms) kd (1/s) KD (M)
BSA&兔抗3D5

2.21E+05

1.90E-05

8.61E-11

BSA&兔抗6B7 1.39E+05 7.49E-06 5.38E-11
BSA&鼠抗1 2.81E+04 1.39E-04 4.95E-09
BSA&鼠抗2 1.48E+05 2.02E-05 1.36E-10

剩余未分选的B细胞以及筛选阳性的其他单B细胞可以冻存,以便用于后续筛选其他应用需求的抗体。

联系我们

如果您对我们的单克隆抗体开发技术服务感兴趣,您可以直接点击阅读原文或点击文字链接,实时与我们项目经理沟通!服务咨询电话:027-87001869

 

普健生物(AtaGenix)于2012年在武汉成立,作为武汉国家生物产业基地公共服务平台—光谷抗体发现与筛选公共服务平台。普健生物(AtaGenix)专注于重组蛋白、抗体、诊断原料、抗体药物发现等自主技术平台的建设和下游生物医药产品的战略合作。经过10年的发展,普健生物已成为一家立足武汉,业务覆盖全国、辐射全球的高新技术服务企业。目前公司拥有4200平米自建实验室(包含800平高标准BSL-2级细胞房),拥有齐全蛋白抗体开发设备500余套,包括高通量蛋白纯化仪、Agilent 流式细胞分析仪,全自动HPLC分析仪,openSPR蛋白、抗体亲和力测定仪,Olympus荧光显微镜,BTX电融合仪,2*7L微生物发酵罐,中试型高压均质机,全自动管式化学发光仪,以及配套的高速离心机,细胞计数仪及大容量细胞培养摇床。公司先后获得荣誉:3551人才计划、高新技术企业、技术先进型服务企业、光谷瞪羚企业
 
 

普健生物依托自主研发的高通量活性蛋白表达系统,Single B细胞抗体发现技术平台,噬菌体展示抗体库技术和杂交瘤抗体开发平台,抗体表达、抗体人源化和稳定细胞株构建平台,与各研究机构展开技术服务项目合作,助力IVD检测、疫苗生产、重组抗体开发。

普健生物一站式抗体发现平台,专注于活性蛋白,功能性抗体开发。

 

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