RIG-I 样受体（RLR）是细胞质内识别双链 RNA 的感受器，而双链 RNA 是多数 RNA 病毒复制时产生的典型信号。在哺乳动物中，这个家族的两个主要成员分工明确：RIG-I 负责识别带有 5′ 三磷酸基团（5′ppp）的短链双链 RNA，MDA5 负责识别长的双链 RNA，两者再通过接头蛋白 MAVS 启动 I 型干扰素应答。这一分工在硬骨鱼中并不成立。RIG-I 在多个硬骨鱼类群中独立丢失，涉及现代硬骨鱼中相当大的比例，而这些鱼类依然具备完整的 I 型干扰素系统，说明对病毒 RNA 的识别由其他受体承担。此前在同样缺失 RIG-I 的鮸状黄姑鱼中已有报道，其MDA5可以直接识别病毒来源的5′ppp-RNA，但同一个受体如何兼容两类性质不同的配体，一直没有得到解释。大黄鱼（Larimichthys crocea）是我国重要的海水养殖经济鱼类，基因组中同样缺失RIG-I。本研究以大黄鱼为模型，系统回答三个问题：大黄鱼基因组中是否真的不存在任何RIG-I残迹；若不存在，哪一个受体承担了对5′ppp-dsRNA的识别；以及单一受体在结构层面如何同时兼容5′ppp-dsRNA和长链dsRNA两类性质不同的配体。
研究人员首先要确认，RIG-I 的缺失是真实的，而不是基因组注释的疏漏。共线性分析、全基因组序列比对和引物扩增三条互相独立的路线给出了一致的结果：大黄鱼基因组中找不到RIG-I的任何痕迹，连 RIG-I 最重要的调控因子 RNF135 也一并缺失。功能相关的基因在进化中常被共同清除，这一点从侧面支持丢失是真实事件。反差出现在功能层面。把RIG-I的经典配体5′ppp-dsRNA送入大黄鱼细胞后，多种 I 型干扰素和干扰素刺激基因依然被明显激活；而去掉5′ppp基团、序列完全相同的对照 RNA 则不能引起这种应答。基因已经不在，识别能力却保留了下来，说明细胞内存在另一个承担这项任务的受体。
能识别双链RNA的受体不止一个：内体中的TLR3和TLR7负责胞外来源的配体，胞质中的RLR负责进入细胞内部的配体。作者用siRNA逐一敲低这三个候选者，观察哪一个的缺失会让应答消失。分工相当清晰。凡是进入胞质的配体——无论是RIG-I 型的 5′ppp-dsRNA，还是 MDA5 的经典配体长链双链RNA——应答都只依赖 LcMDA5；而胞外加入的配体由两个TLR负责，与LcMDA5无关。敲低 LcMDA5 后，下游信号分子的磷酸化水平同步下降。说明在大黄鱼细胞中，一个 MDA5 同时兼管了本应分属 RIG-I 和 MDA5 的两类配体
功能上的依赖不等于物理上的结合，作者接着做了RNA拉取实验。无论是外源表达还是内源水平的LcMDA5，都能被5′ppp-dsRNA和长链双链RNA捕获，加入未标记的同种RNA可以竞争掉这种结合。关键仍在对照组：序列完全相同、只是去掉 5′ppp基团的RNA无法捕获LcMDA5。识别针对的是5′ppp这个化学基团本身，而不是某段序列。说明LcMDA5 直接结合两类配体，对 5′ppp 的识别具有基团特异性。
接下来的问题是，一个结构域如何容纳性质不同的两类配体。结构预测显示，两种复合物的整体架构相似：蛋白的各个结构域围成一个环，把 RNA 双链箍在中间。差别只在 C 端结构域的朝向。面对带 5′ppp 的短双链时，C 端结构域上的一段“加帽环”扣住双链末端，形成容纳 5′ppp 的空腔，这与人 RIG-I 的结合方式相似；面对长双链时，同一结构域转为与双链平行，让长链得以从环中穿过。两种姿势彼此排斥，不能同时成立。分子动力学模拟与结构置信度分析指向同一点：这段加帽环在没有配体时较为柔软，结合配体后被固定下来。结果说明，C端结构域的构象可塑性，是同一个受体容纳两类配体的结构基础。
模型预测了两套部分重叠的结合界面，作者用点突变逐一验证。结果与预测一致：一组残基同时影响两类配体的结合，另一组只在识别 5′ppp 时起作用——突变后，细胞对 5′ppp-dsRNA 的结合和应答明显下降，对长双链的识别却不受影响。这一差别随后被放到病毒感染中检验。水疱性口炎病毒是公认由 RIG-I 识别的模式病毒，其 RNA 能诱导 LcMDA5 聚合，去掉末端磷酸后这种能力消失；在MAVS被沉默的细胞中过表达STING，信号可以恢复。所以对 5′ppp 的识别不只是结构模型上的细节，而是真实影响抗病毒防御的功能。
最后是下游通路。哺乳动物中 MDA5 基本只经 MAVS 传递信号，STING 主要服务于 RIG-I；而在大黄鱼中，LcMDA5 与 MAVS 和 STING 都能结合并共定位，两者都能增强它对干扰素启动子的激活。沉默其中任何一个，下游磷酸化和干扰素转录都会下降，说明两者缺一不可。
两者的先后顺序由一组互补实验确定：敲低 STING 会同时抑制由MDA5和由 MAVS 引发的应答，敲低MAVS则只影响MDA5的那一端；在MAVS被沉默的细胞中补回STING，信号可以恢复。整个复合物的组装依赖MDA5 N端的CARD结构域。信号沿MDA5→MAVS→STING→TBK1/IRF3 的顺序传递，STING位于MAVS下游，这与哺乳动物的模式不同。
在丢失了 RIG-I 的大黄鱼中，MDA5 同时扮演两个角色：既识别本属于 RIG-I 的 5′ppp-dsRNA，也识别自己的经典配体长链双链 RNA，并通过一条统一的 MAVS–STING–TBK1/IRF3 通路启动干扰素应答。结合实验、结构模拟与突变验证三方面证据互相印证。值得注意的是，拥有 RIG-I 的斑马鱼，其 MDA5 在体外同样能结合两类配体。这说明功能重叠未必是 RIG-I 丢失之后的代偿，更可能是丢失得以发生的前提。类似的MDA5与STING偶联在同样缺失 RIG-I的鸡和树鼩中也有报道，提示这是一种趋同的解决方案。也要看到，结构层面的结论来自预测模型与模拟，尚无实验解析的复合物结构，C端之外的结构域是否参与配体选择同样有待研究。对水产领域而言，针对 MDA5 激活优化的双链RNA 分子，是疫苗佐剂值得关注的方向。
本研究中用于共免疫沉淀与Western blot的LcMAVS 多克隆抗体由普健生物（AtaGenix）制备。大黄鱼等非模式物种缺乏商品化抗体，相关研究通常需要依据目标蛋白序列定制抗原设计与免疫方案；本文中该抗体用于检测内源LcMAVS与 LcMDA5、LcSTING的相互作用及敲低效率验证。
普健生物（AtaGenix）将继续提供高质量的抗体定制、蛋白表达等一站式专业技术服务，
助力更多科研突破。
联系我们
