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肝细胞癌（HCC）是全球癌症相关死亡的第三大原因，晚期患者5年生存率低于20%，现有治疗如手术切除和靶向药物虽可缓解，但复发率高且耐药性问题突出，仍需开发增强肿瘤特异性T细胞浸润的免疫疗法；个性化neoantigen mRNA疫苗通过靶向肿瘤突变衍生抗原，有望激活强效免疫应答，而mRNA递送系统的肝脏优先分布可能导致肝损伤，因此设计脾靶向脂质纳米颗粒（LNPs）以提升疗效和安全性成为关键研究方向。
Figure 1. L242-20Lipo在体内递送个性化新抗原mRNA
筛选和优化用于脾脏靶向mRNA递送的LNPS
研究初期通过合成离子化脂质库，筛选出25种候选物，配制含18:1 PA的LNPs，体内递送GFP mRNA显示L221和L242转染效率最高。进一步优化L242-20Lipo摩尔比，体内荧光素酶mRNA递送实验表明其脾脏蓄积显著，肝脏分布最小，脾肝信号比较对照高4.5倍，理化表征证实表面电荷调控提升了脾选择性（Fig.2E-H）。此发现为后续免疫靶向奠定了基础。
Figure 2. 脾脏靶向脂质纳米颗粒的筛选
脾脏靶向脂质纳米颗粒(LNPS)对树突状细胞(DCs)的影响
为评估脾靶向LNPs对树突状细胞（DCs）的效应，研究在Ai14报告小鼠中递送编码Cre重组酶的mRNA，通过tdTomato表达追踪转染细胞亚群。结果显示，Cre-L242-20Lipo在DCs中的摄取率达27%，较对照L0315-20Lipo高3.4倍，且剂量依赖性GFP mRNA递送进一步证实其DCs靶向优势。随后，递送neoantigen mRNA（Hepa-M01-mRNA）后，DCs中CD40和CD86表达分别提升7.5倍和5.7倍，ELISA检测显示IL-12和TNF-α分泌显著增加。这一系列结果表明，L242-20Lipo高效促进DCs的抗原摄取和激活，为neoantigen疫苗诱导强效免疫应答奠定了基础。
Figure 3. mRNA展示中关键细胞的探索
B16M01-mL242在B16F10肿瘤模型中的验证
在B16F10黑色素瘤模型中，研究团队通过B16M01-mL242疫苗以0.5 mg/kg剂量进行三次接种，成功激发了脾脏和淋巴结中的T细胞激活。这一策略显著增强了免疫反应，表现出肿瘤体积和重量的显著减小，同时显著延长了小鼠的生存期。通过深入分析，研究发现疫苗接种后肿瘤浸润性淋巴细胞（TILs）中的CD8+ T细胞表现出强劲的IFN-γ分泌能力，表明该疫苗在诱导针对黑色素瘤的抗肿瘤免疫反应方面效果显著。
Figure 4. T细胞反应和B16M01-mL242的抗肿瘤疗效
NeoPol-mL242在原位肝细胞癌模型中的抗肿瘤免疫作用
为了在原位HCC模型中评估NeoPol-mL242的抗肿瘤免疫，研究团队将NeoPol设计为包含Hepa-M01至M07的七个neoantigens，小鼠接受三次疫苗接种，通过体内成像系统监测肿瘤进展，结果显示NeoPol-mL242组肿瘤负担较对照组降低约90%，0.5 mg/kg组展现显著生存延长和体重稳定；进一步检测发现疫苗治疗组肿瘤中CD8+ T细胞浸润水平更高，Ki67和TUNEL测定显示肿瘤细胞增殖能力显著下降、凋亡率升高，这些发现表明NeoPol-mL242有效激活抗肿瘤免疫，抑制HCC生长。
Figure 5. NeoPol-mL242疫苗的免疫特异性
NeoPol-mL242疫苗的免疫特异性
基于上述结果，研究进一步评估NeoPol-mL242疫苗的免疫特异性，通过肽-MHC tetramer染色分析neoantigen特异性CD8+ TILs和中心记忆CD8+ T细胞（TCMs，CD44+ CD62L+），结果显示疫苗组肿瘤内neoantigen特异性CD8+ T细胞比例更高、CD8+ TCMs显著增加，其中Anti-mouse MHC-Tetramer-PE (Ptpn2376-384(RWLYWQPTL): H-2Kb)由普健生物提供，为验证特异性，研究人员用七个neoantigenic peptides或野生型peptides刺激BMDCs，然后与疫苗组小鼠脾T细胞共培养，ex vivo IFN-γ ELISPOT和流式细胞术显示NeoPol-mL242组T细胞激活明显，CD69+和IFN-γ+ T细胞频率统计显著增加、斑点形成细胞呈剂量依赖性升高3.8倍、CD69+ NK细胞比例达10.8%，野生型对照无效；此外，从疫苗组分离的CD8+ T细胞与Hepa1-6细胞共培养诱导约42%靶细胞凋亡，TNF-α分泌显著升高（对应Fig. 6L-N），这些数据证实NeoPol-mL242通过DCs依赖途径诱导neoantigen特异性T细胞免疫，增强肿瘤杀伤能力。
Figure 6. BMDCS与来自免疫小鼠的脾脏T细胞共培养的示意图
NeoPol-mL242疫苗在小鼠中的安全性评估
在小鼠中进行NeoPol-mL242疫苗的安全性评估，通过血清生化和组织病理学分析，观察到肝酶AST和ALT短暂升高，于24 h峰值后72 h内恢复正常，无ALP、ALB或TP水平显著差异；ELISA量化血清炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α和IP-10显示接种后2 h短暂升高，一周内恢复基线；主要器官（肝、心、脾、肺、肾）组织病理学无病理改变，注射后6个月无组织损伤；GFP mRNA-L242-20Lipo的药代动力学显示血浆中mRNA残留主要在脾脏，96 h后几乎检测不到，这些结果证明NeoPol-mL242无急性毒性，安全谱良好，低剂量即可诱导鲁棒T细胞应答而无显著炎症或损伤。
Figure 7. NeoPol-mL242 mRNA疫苗在小鼠中的安全性评估
此研究聚焦于脾靶向NeoPol-mL242 mRNA疫苗在肝细胞癌（HCC）模型中的应用，通过优化L242-20Lipo递送系统实现了高效的脾选择性mRNA递送与DCs激活，显著减少肝毒性。在黑色素瘤和HCC模型中，疫苗成功诱导强效T细胞应答，有效抑制肿瘤生长并延长生存，展现了其在癌症免疫疗法中的突出潜力。
当前，mRNA疫苗如BNT111在黑色素瘤中取得进展，但肝靶向限制了其在HCC中的应用，脾靶向LNPs的创新结合AI预测技术有望推动疗效提升与副作用降低，预示着未来免疫治疗的新方向。
本研究中，关键的Anti-mouse MHC-Tetramer-PE (Ptpn2376-384 (RWLYWQPTL) :H-2Kb) 由AtaGenix Laboratories Co., Ltd. (Wuhan, PR China) 定制开发提供。AtaGenix 长期专注于高质量蛋白与抗体产品的开发，提供从抗体发现、定制开发到大规模生产的一站式服务，助力科研工作者高效推进机制研究与靶点验证。
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