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神经病理性疼痛（neuropathic pain, NP）是一种由外周或中枢神经损伤引起的慢性顽固性疼痛，常伴随焦虑、抑郁等情绪障碍。其发生机制复杂，涉及神经元兴奋性改变、突触可塑性异常以及多层次的基因表达调控。近年研究显示，RNA甲基化等表观转录组学修饰在神经系统疾病中具有重要作用，其中m⁶Am修饰位于mRNA 5′端帽结构邻近的腺苷，影响mRNA稳定性与翻译效率, 对慢性疼痛可能具有重要影响。已知PCIF1是催化m⁶Am修饰的关键甲基转移酶，Serpine1 mRNA结合蛋白1（SERBP1）是一种具有伴侣功能的mRNA结合蛋白，在mRNA稳定性、神经发生和突触形成中发挥重要作用。然而，PCIF1/SERBP1以及m6Am在神经病理性疼痛发生中的作用尚不清楚。
PCIF1在神经损伤后显著上调，特异分布于S1HL兴奋性神经元
针对上述问题，作者采用多种神经病理性疼痛动物模型（SNI、CCI、化疗或2型糖尿病模型等）进行系统研究。在坐骨神经结扎（SNI）小鼠模型中，m⁶Am修饰水平在对侧初级躯体感觉皮层后肢区（S1HL）显著升高，伴随PCIF1蛋白表达显著上调。免疫染色显示，该上调主要发生在S1HL第5层兴奋性神经元，而在炎症性疼痛和慢性应激模型中，PCIF1水平未见明显变化。这提示外周神经损伤特异性诱导了对侧S1HL中PCIF1蛋白的上调，这可能是m6Am水平升高的原因。PCIF1的变化是神经损伤特异性反应。
Fig. 1 神经病痛导致S1HL中m6Am和PCIF1蛋白水平升高
细胞分型分析显示，PCIF1的上调主要局限于S1HL区域第5层的谷氨酸能（兴奋性）神经元。免疫荧光双标结果表明，PCIF1主要表达于神经元，而在小胶质细胞中无明显分布。进一步利用特异性标记不同层兴奋性和抑制性神经元的小鼠模型结合单细胞RT-PCR检测发现，SNI后PCIF1的表达升高仅发生在对侧第5层的兴奋性神经元中，其他层的兴奋性神经元及各层的抑制性神经元均未出现明显变化。激光捕获微区分离的结果同样支持这一定位结论。
抑制PCIF1可缓解疼痛行为与神经元过度兴奋
为探究S1HL兴奋性神经元中PCIF1上调的功能意义，研究团队在该类神经元中特异性敲低PCIF1，结果发现这不仅阻断了神经损伤后PCIF1蛋白的升高，还显著减轻了机械性和热性疼痛敏感，说明PCIF1的上调对神经病理性疼痛的发生至关重要。进一步结合在体钙成像与脑片电生理发现，PCIF1缺失可消除神经损伤引起的神经元Ca²⁺信号增强及放电频率升高，提示其在维持兴奋性神经元过度活化中发挥关键作用。
Fig. 2 S1HLGu PCIF1的增加对于神经性疼痛的诱导和维持是必需的
为了验证PCIF1上调是否足以引发疼痛状态，研究团队在未受神经损伤的正常小鼠S1HL兴奋性神经元中过表达PCIF1。结果显示，这些小鼠在无外周神经损伤的情况下，仍出现了类似神经病理性疼痛的行为，包括痛觉过敏、热痛阈降低及焦虑样表现，并且在条件性安慰偏好实验中呈现自发性疼痛迹象。这一效应在运动皮层过表达PCIF1时未出现，提示S1HL是该作用的关键区域。
Fig. 3 上调S1HLGluPCIF1诱导神经性疼痛样行为
PCIF1过表达可直接诱发疼痛表型
在细胞水平上，PCIF1上调显著增强了S1HL兴奋性神经元的兴奋性。无损伤小鼠在S1HL同时注射AAV-DIO-Pcif1和AAV-DIO-GCaMP6s后，面部疼痛刺激可引发更强的Ca²⁺信号反应。脑片记录结果也显示，这些神经元在去极化刺激下的放电频率显著高于对照组。这些结果表明，PCIF1升高可直接促进兴奋性神经元的去极化响应与放电活动，从而可能驱动疼痛中枢的异常兴奋。
Fig. 4 PCIF1升高可直接驱动疼痛中枢的异常兴奋
PCIF1与SERBP1在神经损伤后形成增强的复合体
为探究PCIF1在神经元中的作用机制，研究者利用内源性PCIF1免疫共沉淀结合定量质谱，鉴定出SERBP1是PCIF1的主要互作蛋白。在细胞系和小鼠模型中均证实，两者可形成复合体，其结合在神经损伤后显著增强，而PCIF1下调可阻断这一增强。这些结果说明，PCIF1与SERBP1在神经元中协同工作，通过形成复合体介导特定mRNA的m⁶Am修饰，从而实现对神经元功能的选择性调控。
Fig. 5 SERBP1和PCIF1相互作用并共同催化mRNA上的m6Am修饰
在本研究中，所用的SERBP1蛋白由AtaGenix采用昆虫细胞表达系统定制生产，为验证蛋白互作和下游功能提供了核心试剂支持。
靶mRNA的m⁶Am修饰变化及功能后果
接着，为确定PCIF1–SERBP1复合体的下游作用靶点，研究人员结合m⁶Am-Exo-Seq和RNA免疫共沉淀测序，筛选出多个候选基因，其中Maf1（RNA聚合酶III抑制因子）mRNA最为显著，Maf1编码的蛋白参与神经元突触结构调控。实验发现，外周神经损伤后，S1HL中Maf1 mRNA的m⁶Am修饰水平显著升高，而在兴奋性神经元中敲除PCIF1可完全阻断这一变化。
Fig. 6 S1HL 中 Maf1 基因上 m6Am 峰
进一步检测显示，SNI会增强PCIF1与Maf1 mRNA的结合，而PCIF1缺失可消除这一增强。此外，下调SERBP1同样能抑制Maf1 mRNA的m⁶Am水平升高，提示SERBP1参与该修饰过程。结果表明，在神经损伤条件下，PCIF1–SERBP1复合体促进了Maf1 mRNA的m⁶Am修饰，从而可能影响神经元功能。
PCIF1–SERBP1复合体通过m⁶Am修饰调控Maf1 mRNA
MeRIP-seq与验证实验发现，Maf1 mRNA是PCIF1–SERBP1复合体的主要修饰靶点。SNI模型中，Maf1 mRNA的m⁶Am水平显著升高，同时Maf1蛋白表达下降。敲低PCIF1或SERBP1均可阻断这一变化，表明二者协同介导了靶mRNA的修饰。
Fig. 7 增加的PCIF1导致SNI诱导的MAF1在S1HL中的下调
MAF1功能验证
下调MAF1可在正常小鼠中模拟PCIF1过表达的疼痛和神经元兴奋表型，而恢复MAF1表达则部分逆转PCIF1上调所致的行为学和电生理变化。这证实了MAF1是PCIF1–SERBP1–m⁶Am修饰通路的关键功能下游。
在未受损的小鼠中，AAV介导的shRNA敲低MAF1可引发机械性和热痛敏感，同时伴随S1HL神经元钙信号反应增强及自发放电频率升高，说明MAF1下降本身即可驱动疼痛相关神经功能变化。在PCIF1过表达模型中，AAV恢复MAF1表达可明显缓解疼痛敏感性，并降低神经元的过度钙反应与放电频率。这些结果表明，MAF1在PCIF1–SERBP1–m⁶Am通路中具有关键抑制作用，可限制神经元过度兴奋并缓解疼痛状态。
Fig. 8 S1HLGlu神经元中的SERBP1-PCIF1复合体如何参与神经性疼痛和并发焦虑的发育与维持
总的来说，这项研究发现，在神经性疼痛合并焦虑的小鼠模型中，初级躯体感觉皮层后肢区（S1HL）第5层兴奋性神经元内，PCIF1特异性上调并与SERBP1结合，促进Maf1 mRNA 5′端m6Am修饰沉积，从而抑制MAF1蛋白表达，增强神经元兴奋性并引发疼痛和焦虑样行为。提示SERBP1–PCIF1–MAF1通路是神经性疼痛与焦虑的重要分子机制和潜在治疗靶点。
普健生物（AtaGenix）为研究团队提供了高纯度、高生物活性的重组SERBP1蛋白，用于体外m6Am催化实验来验证SERBP1在PCIF1介导的m6Am修饰中的作用。SERBP1蛋白由杆状病毒-昆虫细胞表达系统生产，经过严格质控，确保了实验的稳定性和可重复性。
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