AtaGenix助力揭示古菌细胞周期的波浪式转录调控机制

细胞周期是细胞生长、DNA复制与细胞分裂的精密协调程序，是所有细胞生物增殖的核心过程。在真核生物中，这一程序的运行依赖于细胞周期蛋白（cyclin）与细胞周期蛋白依赖性激酶（Cdk）的协同调控，以及G1、G2/M和纺锤体（M期）三个关键检验点的质量把控。

嗜热嗜酸古菌目（Sulfolobales）是研究古菌细胞周期的模式系统。其细胞周期同样划分为G1、S、G2、M、D各期，细胞分裂器官及染色体分离机制均与真核生物存在深刻的平行关系。然而，Sulfolobales细胞周期相变的转录调控机制此前仍很大程度上未被阐明。山东大学CRISPR与古菌生物学研究中心的研究人员在《Nucleic Acids Research》发表了一篇研究，系统揭示了Sulfolobales中以"波浪式抑制—去抑制"为核心的细胞周期调控机制。

研究人员首先关注了先前已鉴定的细胞周期转录调控因子aCcr1的同源蛋白谱系。在Saccharolobus islandicus REY15A基因组中，共编码5个RHH（ribbon-helix-helix）结构域转录因子，分别为aCcr1、aCcr2（SiRe_1157）、aCcr3（SiRe_1577）、SiRe_1373和SiRe_0131。

通过RT-qPCR分析了同步化细胞在各细胞周期阶段各基因的转录水平，发现accr1与accr3呈现出明显的周期性表达模式：aCcr1蛋白峰值出现于胞质分裂期（M/D期），aCcr3峰值对应G1-S过渡阶段，且aCcr1峰值约早于aCcr3 1小时。相比之下，accr2及其余同源基因在整个细胞周期中稳定表达。Western blot结果进一步在蛋白水平证实了上述时序特征，其中aCcr1条带位置异常偏高，提示其存在翻译后修饰。这一结果确立了三个aCcr蛋白的基本分工：aCcr2作为持续表达的全程调控因子，aCcr1和aCcr3则在特定细胞周期节点执行阶段性调控任务。

为明确aCcr2、aCcr3在细胞周期调控中的功能，研究人员在Saccharolobus islandicus中构建了阿拉伯糖诱导的过表达菌株。结果显示，aCcr2和aCcr3的过表达均导致细胞明显的生长迟缓、细胞体积显著增大，以及基因组拷贝数升高，与先前报道的aCcr1过表达表型高度一致。

但三者在具体表型上存在细微差异：aCcr2过表达引起最强烈的生长抑制，而aCcr3过表达程度居中；流式细胞术分析显示，诱导24小时后，aCcr3过表达细胞中以2C DNA含量为主，提示细胞阻滞于G2/M前，而aCcr1和aCcr2过表达细胞则主要呈多倍体，提示细胞分裂而非基因组复制受阻。这一差异从表型层面揭示了三个aCcr在调控靶点上的分工差异。

研究人员进一步通过凝胶迁移实验（EMSA）分析了aCcr1、aCcr2、aCcr3与胞质分裂启动基因cdvA启动子的体外结合特性。结果表明，三者均能特异性结合cdvA启动子，但解离常数（KD）存在显著差异：aCcr3的亲和力最高，aCcr1居中，aCcr2亲和力最低。这一梯度亲和力特征说明，当aCcr2因磷酸化修饰而丧失DNA结合活性时，高亲和力的aCcr1或aCcr3可通过竞争性占据同一启动子区域，重新建立转录抑制，从而实现细胞周期基因的有序再抑制。不同亲和力的层级组合为"抑制—去抑制—再抑制"的时序调控提供了分子基础。

研究人员对aCcr2和aCcr3过表达菌株进行了全基因组转录组分析，并与aCcr1过表达的已发表数据进行了系统比较。在aCcr2过表达条件下，437个基因上调、384个下调；aCcr3过表达则导致314个基因上调、260个下调；而aCcr1过表达仅影响76个上调和124个下调基因。三者共同下调的50个基因中，20%为已知必需基因，48%呈周期性表达，60%位于转录活跃的染色体A区。这50个基因主要涉及细胞分裂（cdvA、cdvB、cdvC）、染色体分离（segA、segB、segC）、DNA复制与修复（orc1-1、gins、endoMS）及染色质组织（cren7）等核心细胞周期过程。

进一步的ChIP-seq分析在全基因组范围内鉴定了aCcr2的1407个结合峰位，远多于aCcr3的224个和aCcr1的610个。对比分析表明，aCcr2的结合基序变异度较高，可能解释了其调控基因数目最多的现象；而aCcr1和aCcr3的基序更为严格，对应其在特定细胞周期时点的精准调控功能。

aCcr2的持续高表达意味着必须存在某种机制，在细胞周期特定时点将其失活，以解除对关键基因的抑制。研究人员注意到，在同步化细胞中，仅ePK2（真核样激酶，现更名为aCcrK）呈现出明显的周期性表达，峰值出现于G2末期——恰好对应细胞即将进入分裂期的关键窗口。

体外实验证实，aCcrK能够特异性地磷酸化aCcr2，对aCcr1和aCcr3则没有类似作用，这种底物特异性提示磷酸化事件具有精确的调控意图而非随机修饰。经过修饰的aCcr2对DNA的结合能力显著下降。质谱分析鉴定磷酸化位点为Ser24和Thr49，Ser24位点是其中最关键的——携带磷酸模拟突变S24E的aCcr2几乎完全失去了与启动子结合的能力，在细胞中也不再引发生长抑制或形态异常。Thr49位点的作用相对温和，Thr6的磷酸化效果则通过结构模拟和突变实验得到了独立验证。

上述结果表明，aCcrK介导的aCcr2磷酸化是细胞进入M期前，解除对关键基因转录抑制、许可细胞周期推进的核心分子机制。