目标蛋白死活不表达？4个容易被忽略的系统性原因

做蛋白表达的人，大概都经历过这一幕：载体测序没问题，转化、诱导、纯化每一步都按标准流程走，最后跑胶——什么都没有。第一反应往往是怀疑自己哪里操作失误了。但实际上，不表达这件事背后，大多数情况不是操作问题，而是几个容易被忽略的系统性因素。

如果目的基因来自人源或其他真核生物，却直接扔进大肠杆菌表达系统，很可能撞上密码子使用偏好的坑。大肠杆菌对某些稀有密码子对应的tRNA丰度极低，翻译到那个位置直接"卡壳"，轻则表达量低到检测不出，重则提前终止翻译产生截短蛋白。已有研究证实，大肠杆菌中AGG、AGA、CUA、AUA、CGA、CCC这几个密码子是使用频率最低的稀有密码子，其在基因中的相对位置与蛋白表达受抑制的程度直接相关。

Figure 1. 不同调控系统中AGG插入次数与蛋白质表达量之间的关系 （图源：DOI: 10.1038/srep20608）

传统方案是用商业密码子优化工具，直接替换成宿主偏好密码子。但一个值得关注的新方向是2025年天津工业生物技术研究所团队发表的DeepCodon——一个基于深度学习的密码子优化工具，特别之处在于会保留那些在进化上保守、功能上重要的稀有密码子簇，而不是像传统方法一样粗暴地全部替换成高频密码子。原因是简单替换稀有密码子虽然能提升表达量，但也可能打乱翻译动力学节奏、破坏共翻译折叠过程，反而导致蛋白不溶或没有活性。这个思路对于"表达量上去了但活性没了"这类问题特别有参考价值。

Figure 2. 数据收集和模型体系结构 (图源：https://doi.org/10.1016/j.bidere.2025.100042)

有些序列在mRNA层面会自己折叠出发夹结构，正好把RBS（核糖体结合位点）附近区域包住，翻译起始效率断崖式下降。这种问题用普通的诱导条件优化很难解决，需要在设计阶段就预测mRNA的二级结构自由能。

Figure 3. 细菌翻译起始过程的热力学模型 （图源：doi:10.1038/nbt.1568）

某些蛋白（尤其是膜蛋白、某些酶、部分病毒蛋白）表达出来会干扰宿主菌自身的代谢或膜完整性，宿主会本能地抵制高效表达这个蛋白，哪怕加了足够的诱导剂、诱导培养时间也够了，菌体密度反而不涨或提前裂解，最终大量蛋白被归到不溶的包涵体里。

已有研究比较发现，用pG-KJE8这种五种伴侣蛋白联合的质粒共表达单链抗体，得到的可溶性表达效果最好，能实现目的蛋白完全以可溶形式表达。这是"哪种组合对应哪类蛋白"的选择逻辑，多数客户并不清楚伴侣蛋白还分这么多种组合。业内常用的伴侣蛋白共表达系统其实有明确的组合可选：

• pG-KJE8（DnaK-DnaJ-GrpE-GroES-GroEL五种伴侣蛋白联合）
• pGro7（GroES-GroEL组合）
• pKJE7（DnaK-DnaJ-GrpE组合）
• pG-Tf2（GroES-GroEL-Trigger factor组合）
• pTf16（单独Trigger factor）

Figure 4. 重组pET22b-ScFv表达载体的示意图 （图源：DOI: 10.30498/IJB.2020.138200.2314）

另外，冷休克表达系统通过在较低温度（15-37℃）诱导表达，既能提升目的蛋白产量和纯度，又能抑制宿主自身蛋白的干扰表达，同时提高目的蛋白的可溶性，这也是"降温降浓度"这条经验背后更系统化的技术逻辑，而不只是口口相传的经验之谈。

不是所有蛋白都适合大肠杆菌，需要糖基化修饰、二硫键复杂、或者本身依赖真核翻译后加工的蛋白，硬上原核系统大概率会拿到不溶性的包涵体，甚至完全测不到目的蛋白。这种情况下，昆虫细胞或哺乳动物细胞表达系统虽然周期更长、成本更高，但往往是唯一能拿到有活性、正确折叠蛋白的路径。

Figure 5. 主要基因表达系统相关特征的比较概述 （图源：https://doi.org/10.1016/j.xpro.2023.102572）